TY - JOUR ID - TI - Production of Lettuce Edible Vaccine for Cholera Disease Using Chloroplast Genetic Engineering. انتاج لقاح الخس المأكول لمرض الكوليرا باستخدام الهندسة الوراثية للبلاستيدات الخضراء AU - Ahmed A. Suleiman احمد عبد الجبار سليمان AU - Kadhim M. Ibrahim كاظم م. ابراهيم AU - Abdulwahid B. Al-Shaibani عبد الواحد باقر الشيباني PY - 2013 VL - 7 IS - 1 SP - 20 EP - 27 JO - Journal of university of Anbar for Pure science مجلة جامعة الانبار للعلوم الصرفة SN - 19918941 27066703 AB - Lettuce is one of the most important edible plant worldwide. At the timethat lettuce isthe candidate plant to carry the foreign vaccine gene forhuman. The B subunits of toxin of Vibrio cholerae(CTB) are candidatevaccine antigens. This research was conduct to express CTB gene in lettucechloroplast. Genesrequired in this study were obtained by polymerase chain reaction (PCR)technique using specific forward and reverse primers, and these genes wereCTB, BADH, prrnpromoter and many other regulatory genes. Some ofthese genes were isolated from their hosts and some were obtained fromprevious work available at Daniell laboratory. All these genes beside manytechniques for ligation, extension, sequencing, orientation confirmationwere used to construct the cassette vector pLS-BADH-LS-CTB whichcarries the gene of interest. In this work the CTB gene with BADH genewere transferred to the chloroplast of lettuce plant and selection oftransgenic plant was performed on the MS medium containing BA andNaCl without any antibiotic selectable marker. Integration of an unmodifiedCTB-coding sequence into chloroplast genomes (up to 1000 copies per cell)resulted in the accumulation of up to 6.2% of total soluble lettuce leavesprotein as functional oligomers (620-fold higher expression levels than thatof the unmodified CTB gene expressed via the nuclear genome). PCR andSouthern blot analyses confirmed stable integration of the CTB gene andBADH gene into the chloroplast genome in addition to the integration in theright orientation and in specific region between trnaIrnA.Western blotanalysis showed that the chloroplast synthesized CTB assembled intooligomers and were antigenically identical with purified native CTB

يعد نبات الخس واحد من النباتات المأكولة المهمة في العالم , ويتعبر ايضا نبات مرشح لحمل الجينات الغريبة الى الانسان. يعد الجزءB من سم بكتريا Vibrio cholera من الانتجينات المرشحة للعل كلقاح للانسان. صممت هذه الدراسة لنقل جين المسؤول عن انتاج السم B الى البلاستيدات الخضراء لنبات الخس. عزلت الجينات المطلوبة لعمل هذه الدراسة باستخدام تقنية تفاعل استطالة السلسلة PCR والذي استخدم لعزل الجينات التنظيمية مع CTB, BADH and Prrn وقد تم عزل هذه الجينات من اماكن تواجدها باستخدام بادئات خاصة وقسم منها تم عزلها من نواقل كلونة مصممة سابقا لهذا الغرض في مختبرات الدكتور دانيل في جامعة سينترال فلوريدا. استخدمت عدد من التقنيات بجانب تفاعل استطالة السلسلة للحصول على ناقل كلونة يحمل جين السم B وهذا الناقل هو pLS-BADH-LS-CTB , واستخدمت طريقة حقن الجينات باستخدام مسدس الجينات لحقن الجين الى البلاستيدة الخضراء لورقة الخس وتم الانتخاب الوراثي للنباتات المهندسة وراثيا على اساس تحملها للملوحة ومادة البيتايين الديهايد بدلا عن مقاومة المضادات الحيوية وهذا ما جعل هذا العمل اول عمل يتم لانتخاب الكائنات المهندسة وراثيا على اساس تحمل الملوحة. حملت النباتات المهندسة وراثيا جين انتاج لقاح الكوليرا في البلاستيدات الخضراء البالغ عددها حوالي 1000 بلاستيدة وكانت نسبة التعبير الجيني حوالي 6.2% من البروتين الكلية المعزول من النبات. استخدمت تقنية تفاعل استطالة السلسلة وتقنية وصمة ساوثرن لتاكيد المكان الصحيح لدخول الجينات في حين استخدمت تقنية وصمة ويسترن للتاكدي على انتاجية النبات ودقة التعبير الجيني. ER -